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基于液相质谱数据的翻译后修饰分析

PEAKS翻译后修饰分析

蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs),例如磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化等,在多种生物学进程,例如信号和调控、蛋白活化和讲解、基因表达调控等起到了至关重要的作用。PTM的鉴定和表征对于细胞生物学和人类疾病的全面认识是十分必要的,因此也有着广泛的应用。由于蛋白质数据库中通常缺乏或PTM信息并不完整,所以通过质谱技术对PTM进行识别,对传统的数据库检索方法提出了许多挑战。

在PEAKS中包含有改进的算法,是的PTM的鉴定实现最大化,并且能够对PTM进行profiling的表征。通过对de novo测序结果与数据库搜索结果的整合,实现对翻译后修饰的PTM鉴定。PTM的profile工具进一步帮助对PTM的研究,可以提供对定性、定量结果信息,以及对结果的可视化和直接导出。


PEAKS 的PTM分析方法

使用PEAKS的DB search中的PTM鉴定分析
使用PEAKS的PTM模块发现预期外或者隐藏的PTM,使翻译后修饰的鉴定最大化
使用PEAKS PTM Profiling对PTM进行定量分析。


PTM的鉴定 

PTM的鉴定在PEAK中可以由PEASK的DB search功能和PTM search功能模块完成。

通过数据库搜索的方法

在数据搜索的方法中,仅仅对于有限个数的一些常见翻译后修饰可以被定义为可变修饰。

蛋白的结果视图中,鉴定到的支持性多肽证据以蓝色的条,映射到选中的蛋白的序列上。通过点击多肽,该多肽的二级质谱图将会显示出来,你可以很容易地检查质谱数据的注释。

在二级谱图的窗口中显示的多肽序列里,带有修饰的氨基酸残基以小写字母表示,例如在下图中, 序列DTLmISR的甲硫氨酸。

 

通过PEAKS PTM功能模块分析 

PEAKS PTM是整合了强大的de novo算法和数据库搜索算法的,特别为发现隐藏修饰而设计的功能模块。

这种多轮搜索方法在数据分析工作流图所描述:

01. 对每一张谱图进行de novo从头测序。

02. PEAKS的数据库搜索(DB)算法用于对蛋白鉴定。在这一轮中,可以指定一些高频发生的常见PTM,以最大限度地提高灵敏度。

03. PEAKS的PTM算法用于鉴定更多的翻译后修饰。在这一轮,仅仅通过de novo高置信度打分,并且同时没有在数据库中匹配的谱图被映射到已鉴定的蛋白上。用户可以定义任意多个的PTM,或者他们可以简单的运行一轮PTM搜索,可以实现313种Unimod数据库中翻译后修饰的同时检索。

PEAKS PTM模块鉴定到另外的修饰,例如上图,除了在数据搜索得到的,在DTLMISR序列中甲硫氨酸的oxidation(上图黑色)以外,还有一种修饰dethiomethyl(图中红色指向).

PTM位点确证

修饰的确切位置可由谱图中存在决定位点的碎片离子来确定。在下图所示的例子中,MS2谱图中b-11和b-12离子的存在决定了天冬酰胺在第12位发生脱氨基。

PEAKS为用户提供两个选择以确定可信的修饰位点:

01. 最小离子强度,这就要求在MS/MS谱图中确定位点的碎片离子的相对强度必须高于用户输入的数值。

02. Ascore,计算出一个类似-10logP的分数。这里P值表示了随机匹配上这个多肽的可能性。因此,Ascore越高置信度越高。

这两种方法都提供了可以建立PTM位点置信度的评估。如果达到用户选择的方法的阈值,则PTM将位于蛋白质覆盖率视图中氨基酸残基上方的彩色框中。

PTM的定量分析

PEAKS PTM Profile提供了对定量信息直接地可视化和总结(例如,在鉴定到的位点,修饰和未修饰形式的丰度)。

PTM profile的结果可以导出图像和包含有详细定量信息的CSV格式结果。


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