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de novo Sequencing技术背景介绍

多肽从头测序(de novo sequencing)是指在不借助序列数据库的情况下,在串联质谱的方法中,肽段沿着肽骨架碎裂产生一系列的碎片离子,形成MS/MS谱图。基于所使用的碎裂方法,可以知道获得的碎片离子类型。从头测序是利用两个碎片离子之间的质量差来计算肽主链上氨基酸残基的质量。

根据所选择的碎裂方法,可以产生不同的碎片例子类型。目前比较常用的碎裂方法有碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD),CID能产生b离子和y离子,ETD则主要产生c离子和z离子。

图1 在CID碎裂的MS/MS 谱图中,相同肽段的多个拷贝沿着肽骨架碎裂成为b、y离子。产生的谱图由以横坐标为m/z (质荷比)的峰构成,其值由碎片离子的响应构成。高质量的谱图通常包含了许多(但不一定是全部)的理论碎片离子。

难点:

不正确的b、y离子分配
一些离子碎片的缺失
谱图中其他碎片离子类型
谱图中存在噪音峰
高度相似的氨基酸残基质量数,例如Leu和Ile。
PTM造成的氨基酸残基质量数产生歧义,使问题复杂化

以上这些因素,导致可能de novo测序只能从谱图中计算一部分的正确的序列标签。

自动化的de novo测序
手动进行de novo测序的解谱工作要求人员的专业性,并且十分地费时。一个可靠的自动化de novo测序解决方案可以大大地降低人力资源的成本。生物信息学领域对自动化的de novo测序方法进行了广泛的研究,并且开发了多种算法,虽然计算机算法所使用的基本原理与人工de novo测序相同,但计算机算法的计算过程通常与人工分析不尽相同。

PEAKS Studio软件首次发布是在2002年,目前已经发展为了de novo测序领域的行业标准软件。其中,它的精确度,快速分析的能力,以及用户友好性,都广为人知。

结合数据库的使用
过去,人们常认为de novo测序分析的速度非常慢。因此,只有在蛋白质数据库不可用的情况下,才使用de novo 的方法。然而,以PEAKS软件为代表的新发展的计算机算法,速度已经不再是一个问题了。这使得对于蛋白质组得到的每一张质谱图都进行de novo测序成为一种可行的选择。甚至当数据库可用的情况下,de novo测序可以下面所描述的方式帮助多肽的鉴定。

1.de novo测序的结果吐过和数据库搜索得到的结果完全匹配或者具有高度的相似性,那么充分证明搜库结果的正确性。因此,de novo测序能够用于提高数据库搜索的性能。

2.de novo测序得到的肽段如果在数据库中没有显著匹配,可能是在样品中存在全新的肽段,值得进一步确定,有可能发现预期外的PTM或者多肽的突变。

如下图所示,PEAKS Studio软件在设置标准操作流程的时候,已经考虑到了这个问题。

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